引言

生物流体（如血液、尿液、唾液等）中细菌的存在与人类生活和公共健康密切相关。在疾病初期及时、准确鉴定致病菌种类对确认致病菌感染源和阻止疾病传播至关重要。传统细菌检测方法有平板计数法、酶联免疫吸附反应（ELISAs）、聚合酶链式反应法（PCRs）等，这些技术虽然促进了细菌检测的发展，但仍存在耗时长、劳动密集、实验成本高等不足。双重酶级联反应具备更低的活性位点，传质速度快、反应效率高等优势，近年来被越来越多的用于生物传感检测领域。

近期，南京师范大学王琛教授课题组采用一步还原法制备了双重酶级联反应Au@POM 纳米颗粒子，实验采用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为模型，以可见光波段光谱吸收强度为依据，分析细菌代谢过程中葡萄糖浓度与细菌代谢速度关系。实验证明，Au@POM纳米酶级联催化反应在细菌含量为1-7.5 x 10⁷ CFU mL^-1呈线性关系，检测限为5 CFU mL^-1。

结果分析

纳米酶级联催化的细菌检测原理如图1所示，采用一步还原法制备Au@POM 纳米颗粒，金属氧酸盐（POMs）为壳、金纳米粒子（AuNPs）为核。金纳米颗粒（AuNPs）具备葡萄糖氧化酶（GOx）活性，金属氧酸盐（POMs）具备过氧化物酶（HRP）活性，制备的Au@POM 纳米颗粒具备双重酶活性。实验时采用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为模型，在细菌生长和繁殖过程中需要消耗葡萄糖能源，理论上葡萄糖含量越高，细菌含量越低，因此可将葡萄糖含量与细菌含量的线性关系作为细菌定量分析的可行性策略。首先，AuNPs的葡萄糖氧化酶活性将葡萄糖底物氧化为葡萄糖酸，并产生H₂O₂，然后，利用POMs的过氧化物酶活性，将3’,3’5’,5’-四甲基联苯胺（TMB）氧化为TMB⁺,形成强可见光吸收峰。

图1纳米酶级联催化的细菌检测原理示意图。（A） 一步还原法制备Au@POM（B） 级联催化Au@POM纳米酶。（C） 细菌在代谢过程（D）细菌/无细菌生物体系中可见光吸收强度。

图2 (A) Au@POM 纳米颗粒TEM图像，颗粒直径15nm，Au核的POM薄层厚约1nm；（B）SEM图和EDS图谱；（C）纳米颗粒ζ电位图；（D）不同材料XRD图；（E）Au与Au@POM的可见光吸收谱，介电常数改变导致Au@POM红移

图3 （A）不同体系可见光吸收光谱；（B）Au@POMs + Glu + TMB纳米酶级联催化体系可见光吸收谱峰与反应时间关系；（C）对葡萄糖浓度做Michaelis–Menten模型的稳态动力学测定（TMB浓度为1.2mM）；（D）纳米酶级联反应的双倒数图

实验时采用金黄色葡萄球菌作为模型，随着细菌含量增加，吸收峰强度明显降低，在浓度为10-1x10⁷ CFU mL^-1区间，细菌含量与吸收峰强度呈现良好的线性关系，金黄色葡萄球菌检测限为5 CFU mL^-1。作者同步做大肠杆菌对比实验，其吸光度强度随细菌浓度变化趋势与金黄色葡萄球菌相似，结果表明Au@POMs纳米酶级联催化反应具有良好的普适性。

图4 （A）纳米酶级联反应细菌检测原理示意图；（B）不同尺寸金黄色葡萄球菌的暗场视野图像（0,10,10²-10⁷ CFU·mL^-1）；（C）加入不同含量细菌后的可见光吸收光谱图；（D）人体血清样品和PBS缓冲液的细菌检测

结论

本文采用一步还原法合成纳米酶级联反应Au@POMs纳米颗粒，该体系制备的Au@POM 纳米颗粒具备双重酶活性，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为模型，采用暗场显微镜直接观测细菌形貌，并通过不同细菌模型的可见光吸收光谱进行细菌浓度的半定量分析。结果表明，细菌含量与可见光吸收强度具备良好的线性关系。将金黄色葡萄球菌掺入10%血清中，结果与在PBS缓冲液中结果相似，表明该方法在真实样品检测中具备潜在应用，为高灵敏度实施细菌检测提供了有力工具。

南京师范大学王琛教授课题组简介

王琛，南京师范大学化学与材料科学学院教授，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者（2020年），江苏省“青蓝工程"优秀青年骨干教师、中青年学术带头人；南京师范大学本科、硕士，2011年博士毕业于南京大学化学化工学院生命分析国家重点实验室，2012-2016南京大学从事物理学博士后，2016-2017年麻省理工学院（MIT，美国）访问学者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等学术期刊发表研究论文60 余篇；参编英文图书 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多项国家自然科学基金、江苏省重点研发、江苏省自然科学基金等项目；担任Chinese Chemical Letters期刊编委，中国分析测试协会青年学术委员会委员，江苏省材料学会副秘书长。

文章信息

本文以“Nanozyme-catalyzed cascade reaction enables a highly sensitive detection of live bacteria"为题发表在Journal of Materials Chemistry B上，中国药科大学柳文媛教授和南京师范大学王琛教授为通讯作者。

本研究暗场显微图像使用的是北京卓立汉光仪器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦显微拉曼光谱仪，如需了解该产品，欢迎咨询。

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